Значение IFN-y было продемонстрировано повышенной чувствительностью к микобактериальной инфекции у детей с IFN-yR дефицитом. ЛЯ-нокаутные мыши также чувствительны к М. tuberculosis. Каким образом IFN-y опосредует защиту, не ясно.

У человека один IFN-y не эффективен в повышении способности макрофагов контролировать М. tuberculosis. У мышей протективный иммунитет СБ4+Т-клеток также нельзя объяснить одним IFN-y. МНС класса II и С04-нокаутные мыши, производящие большое количество этого цитокина, не способны управлять инфекцией М. tuberculosis. Кроме управления «убивающими» микробы механизмами, IFN-y — также основной регулятор функции антигенпредставляющих клеток, повышающий экспрессию МНС и костимулирующих молекул. Данная функция необходима для оптимального ответа Т-клеток на М. tuberculosis и может являться главной ролью IFN-y в антимикобактериальном иммунитете. Кроме того, как у человека, так и в мышиных моделях, была показана ведущая роль TNF-a и IL-12 в протективном иммунитете против М. tuberculosis. Функция IL-12 заключается в повышении продукции IFN-y. Каким образом TNF-a участвует в протективном иммунитете у человека, неизвестно.

Важны также данные о взаимодействии микобактерий и эпителиальных клеток. В исследованиях in vitro с использованием монослоя альвеолярных эпителиальных клеток было установлено, что эти клетки участвовали в перемещении бактерий как непосредственно, так и путем индукции миграции макрофагов и трансцитоза.

Недавно описан мутант М. tuberculosis, также использующий взаимодействие с эпителиальными клетками в патогенезе заболевания. Бациллы, лишенные гена hbhA, кодирующего гемагглютинин, связывающий гепарин, показали сиижениє адгезии с пневмоцитами (в легком), сохраняя адгезивную способность к макрофагам в культуре in vitro. Мутантная бактерия хорошо размножилась в легких мышей линии BALB/c, инфицированных интраназальным путем, но интенсивность размножения снижалась в 100 раз в селезенке. Внутривенное инфицирование показало отсутствие врожденной неспособности бактерий образовывать колонии в селезенке. Это позволяет предположить, что ген hbhA вносит свой вклад в распространение инфекции в организме хозяина. Однако получены противоположные данные, указывающие на то, что мутанты hbhA недостаточно хорошо развиваются в легких мышей C57BL/6. Кроме того, первоначальное образование колоний в селезенке происходило со скоростью, сравниваемой с таковой у дикого типа, но в последующем мутант был уничтожен. В обоих исследованиях показана роль hbhA в процессе инфицирования.

В последние годы наметились значительные успехи в изучении патогенеза туберкулеза и роли в нем различных бактериальных факторов. Этому способствовало объединение новых технологий со старыми методами изучения микобактерий, что позволило вскрыть важные детали биологии этих патогенов. Установлены многие гены, необходимые для роста in vitro и in vivo (например, гены, контролирующие основные клеточные процессы). Многие из них — потенциальные мишени для антибиотиков, но, к сожалению, они малоинформативны для выяснения отношений между хозяином и патогеном. Для поиска генов, имеющих избирательное значение in vivo, то есть при туберкулезной инфекции, применяли два генетических подхода, которые позволяют выявить важные для вирулентности гены: фильтр экспрессии генов и фильтр мутантов. Нередко эти подходы применяют в сочетании друг с другом.

Непатогенные микроорганизмы внедряются в выделенные в культуре нормальные клетки с такой же легкостью, как и патогенные, но только последние могут выживать и размножаться внутри клеток. Это требование воспроизводства в культуре клеток для патогенности in vivo было подтверждено анализом изогенного ослабления мутантов, когда мутанты, плохо растущие в культуре макрофагов, ослаблены in vivo. Кроме того, рост непатогенных и патогенных бактерий в амебе также отличается.

Центральная роль макрофагов при туберкулезе давно установлена на основании ряда гистологических исследований у инфицированных животных. В процессе инфицирования организма хозяина макрофаг играет противоречивую роль. С одной стороны, он — основной элемент клеточной защиты, с другой, — основное место размножения бактерий. Макрофаги — первые клетки, взаимодействующие с микобактериями, препятствующие инфицированию организма хозяина, но в последующем способствующие их распространению по организму, что было доказано в экспериментах на кроликах и мышах. Наблюдения за развивающимися эмбрионами рыбы-зебры, инфицированными М. marinum, показали, что инфицированные макрофаги мигрировали из кровотока или желудочка мозга в глубжеле-жащие ткани. Наблюдался перенос бактерий от одного макрофага к другому через их клеточные мембраны, а также неинфицированным макрофагам, прибывшим для фагоцитоза мертвых инфицированных макрофагов, что создало новые инфицированные клетки.

При использовании взаимно дополняющих подходов двум группам исследователей удалось установить значение утраты RD1 для ослабления BCG. Так, удаление области RD1 из вирулентного штамма М. tuberculosis H37Rv привело к снижению их роста в макрофагах человека in vitro. Бациллы H37RvrARD1 и бациллы BCG развивались более медленно, по сравнению с М. tuberculosis дикого типа, в организме мышей, и патологический процесс гистологически был менее выраженным. У всех мышей, зараженных М. tuberculosis, в течение 40 нед развивалось заболевание и они погибали. Мыши, инфицированные H37Rv::ARD1, были живы и набирали в весе. Таким образом, все результаты сравнения H37Rv::ARD1 и BCG не отличались друг от друга.

Внедрение RD1 участка М. tuberculosis в гетерологичный сайт хромосомы штамма пастеровской вакцины ВCG увеличивало ее вирулентность при инфицировании мышей. Штамм с восстановленной областью RD1 обладал более длительной устойчивостью у мышей с адекватным иммунным ответом. Эта устойчивость увеличивалась у мышей SCID по сравнению с пастеровской вакциной BCG, хотя она и была ниже, чем у М. tuberculosis. Неспособность RD1 восстанавливать в полной мере вирулентность может быть связана с накоплением дополнительных мутаций в течение 80 лет после появления первой ослабленной вакцины BCG.

Молекулярный механизм, с помощью которого RD1 влияет на вирулентность, не ясен, поскольку неизвестны функции ни одного из поврежденных генов. Все они включают иммунодоминантные М. tuberculosis-спеіщфическш антигены. ESAT-6 и CFP-10, а также РЕ – и РРЕ-гены, входят в семейство генов, которые влияют на вирулентность.

Возможно, разнообразие в Т-клетках, которые отличаются по механизмам про-цессинга антигенов и используемым молекулам для презентации АГ, значительно расширяет репертуар антигенов микобактерий. Способность М. tuberculosis выживать и персистировать в одной из основных антигенпредставляющих клеток — макрофаге — содействует дальнейшей готовности Т-клеточной активации. Медленный рост и хроническая природа М. tuberculosis инфекции приводят к длительной экспозиции широкого разнообразия антигенов. В перспективе для хозяина разнообразие Т-клеточного репертуара позволит признать широкие диапазоны презентируемых микобактериальных АГ различными семействами антигенпрезен-тующих молекул и, таким образом, значительную способность узнавать патоген. Для М. tuberculosis, чтобы быть успешно персистирующим патогеном, необходимо развить механизмы, влияющие на функцию Т-клеток.

CD4+apTCR+T-ioieTKH (СВ4+Т-клетки) — основные клетки в иммунном ответе человека наМ. tuberculosis. Пандемия ВИЧ четко показала, что снижение числа и функции С04+Т-клеток приводит к прогрессированию первичной инфекции, реактивации эндогенного ТВ и повышенной чувствительности к реинфекции. Ранее проведенные исследования по переносу клеток у мышей показали, что СБ4+Т-клетки переносят защиту против М. tuberculosis. Применение моноклональных CD4 антител подтвердило данное утверждение. Мыши с делецией CD4 или молекул класса II МНС генов становились заметно более чувствительными к М. tuberculosis, что еще раз подтвердило центральную роль СБ4+Т-клеток в защите.

Активированные антигенами М. tuberculosis СБ4+Т-клетки человека вместе с секретируемыми активированными макрофагами цитокинами IFN-y и TNF-a/p цитотоксичны (CTL) для инфицированных М. tuberculosis макрофагов и помогают макрофагам контролировать внутриклеточные микобактерий.

После переноса бактерий с помощью макрофагов и, возможно, других фагоцитов в более глубокие ткани, привлеченные макрофаги собираются в отдельный инфицированный узел для образования гранулем. Гранулема — организованная группа различных макрофагов с характерными морфологическими признаками. Гранулемы образуются как ответная реакция хозяина на устойчивые внутриклеточные патогены, такие как Micobacterium, Schistosoma, Brucella, или на посторонние тела. С точки зрения патологоанатомов, для определения гранулем необходимо присутствие в них только макрофагов, но в туберкулезных гранулемах человека и мышей находится также значительное количество Т-лимфоцитов, небольшое число В-лимфоцитов, дендритные клетки, нейтрофилы, фибробласты и внеклеточные компоненты матрикса.

Гены, связанные с процессами анаэробного клеточного дыхания и окислительного стресса.

Долгое время считалось, что М. tuberculosis является строгим аэробом. К настоящему времени, однако, накопились данные, свидетельствующие о возможности анаэробного дыхания микобактерий на поздних стадиях туберкулезной инфекции, например, в гранулемах. С другой стороны, большинство аэробных организмов, в том числе микобактерий, нуждаются в защите от повреждающего действия пероксидов (например, пероксида водорода), которые являются обычными побочными продуктами аэробного дыхания. Таким образом, супероксиддисмутазы и каталазы, обеспечивающие распад пероксидов, являются, по-видимому, немаловажными факторами вирулентности микобактерий.

Нитрат-редуктаза (ген narG) является важным ферментом в цепях анаэробного клеточного дыхания. Экспериментально было установлено, что ее активность в клетках микобактерий значительно возрастает на поздних стадиях туберкулезной инфекции, что доказывает частичное или полное переключение метаболизма микобактерий на анаэробное дыхание.

KatG (каталаза-пероксидаза) является единственной каталазой у М. tuberculosis и отвечает за разрушение пероксида водорода и органических пероксидов. Этот фермент также активирует изониазид, переводя его из формы пролекарства в активную форму, ингибирующую синтез миколовых кислот. Мутанты, дефектные по гену katG, а также по генам sod А и ahpC, кодирующим супероксид-дисмутазы, вызывали очень слабую инфекцию у лабораторных животных вследствие слабой защищенности от повреждающего действия пероксидов и супероксидов в условиях инфекции в легких. Кроме того, последние исследования показали, что супероксиддисмутаза sodA нарушает прохождение начальных стадий клеточного иммунного ответа на внедрение микобактерий в организм хозяина.

Модели, которые можно исследовать генетически (Dictyostelium, дрозофила, рыба-зебра), должны облегчить идентификацию кандидата на организм хозяин, который может быть тестирован в более сложных системах млекопитающих.

На основании лабораторных исследований изучен механизм выживания микобактерий, базирующийся на предотвращении слияния фаголизосом. Это явление характерно для всех изученных видов патогенов (М. tuberculosis, М. avium, М. marinum), кроме патогенного для мышей видаМ. lepraemwium, который располагается преимущественно в фаголизосомах в течение репликативного инфицирования. Более того, в макрофагах, активированных IFN-y, микобактерий обнаруживали в основном в фаголизосомах, и они были мертвыми. Однако в других исследованиях показано, что некоторые виды микобактерий могут выживать в окисленной среде. В случае совместного инфицирования макрофагов в культуре микобактериями и Coxiella bumetti большая часть микобактерий находились вместе с Coxiella в окисленной среде без снижения жизнеспособности. При инфицировании свежевыделейных альвеолярных макрофагов человека М. tuberculosis установлено, что большая часть фагосом, содержащих живые бактерии, находились в близком контакте с лизосомами. После «опсонического влияния» иммунной сыворотки М. tuberculosis проникает в макрофаги через Fc-рецепторы, большая часть из них выживает и даже размножается в фаголизосомах. Предполагается, что внедрение через Fc-рецептор происходит на поздних стадиях инфицирования после образования специфических антител.

Белок Icl (асеА) представляет собой фермент, превращающий изоцитрат в сукцинат в глиоксалатном шунте. Это позволяет микобактериям использовать жирные кислоты в качестве источника углерода, в то время как глиоксалатный шунт способствует включению продуктов в цикл Кребса. Таким образом, ген icl и его продукт отвечают за переключение метаболизма микобактерий, приспосабливая его к персистированию в тканях хозяина, являясь, тем самым, важными факторами вирулентности.

Белки РапС и PanD принимают участие в синтезе пантотеновой кислоты, которая, в свою очередь, необходима для образования ацетил-КоА и других соединений, участвующих в процессах синтеза и деградации жирных кислот. Мыши, зараженные микобактериями, дефектными по генам рапС и panD , жили в среднем в 8 раз меньше, чем в экспериментах с диким типом М. tuberculosis. Следовательно, указанные факторы также являются существенными детерминантами вирулентности микобактерий.

В настоящее время идентифицирован также ряд других генов и генных семейств (fadD, plcA-D), отвечающих за синтез ферментов метаболизма жирных кислот. Сведения о них, однако, достаточно противоречивы и не позволяют сделать однозначный вывод об их роли в вирулентности микобактерий.